TIANSeq NGS bókamagnamagnseining

Sem stendur er raðgreiningartækni með mikla afköst aðallega byggð á næstu kynslóð raðgreiningartækni. Þar sem lestrarlengd næstu kynslóðar raðgreiningartækni er takmörkuð verðum við að skipta röðinni í fullri lengd í lítil brotasöfn til að raðgreina. Samkvæmt þörfum mismunandi raðgreiningartilrauna veljum við venjulega raðgreiningu með einni enda eða raðgreiningu með tvíhliða raðgreiningu. Eins og er er DNA brotum af næstu kynslóð raðgreiningarsafninu almennt dreift á bilinu 200-800 bp.

a) DNA er lélegt að gæðum og inniheldur hemla. Notaðu hágæða DNA sýni til að forðast hindrun á ensímvirkni.

b) Magn DNA sýnis er ófullnægjandi þegar PCR-laus aðferð er notuð til að smíða DNA bókasafn. Þegar inntak brotna DNA fer yfir 50 ng, er hægt að framkvæma PCR-laust verkflæði sértækt meðan á byggingarferlinu stendur. Ef afritanúmer bókasafnsins er of lágt til að hægt sé að raðgreina það beint er hægt að magna DNA bókasafnið með PCR eftir aðlögunartengingu.

c) RNA -mengun leiðir til ónákvæmrar upphaflegrar DNA -mælingar RNA -mengun getur verið til staðar í hreinsunarferli erfðamengis DNA, sem getur leitt til ónákvæmrar DNA -mælingar og ófullnægjandi DNA -hleðslu meðan á byggingu bókasafns stendur. RNA er hægt að fjarlægja með því að meðhöndla með RNase.

A-1

a) Lítil brot (60 bp-120 bp) birtast Lítil brot eru venjulega millistykkisbrot eða dímar sem myndast af millistykki. Hreinsun með Agencourt AMPure XP segulmagnaðir perlur getur í raun fjarlægt þessi millistykkisbrot og tryggt raðgreiningu.

b) Stór brot birtast á bókasafninu eftir PCR mögnun Stærð DNA brotsins á bókasafninu mun aukast um 120 bp eftir að millistykki er tengt. Ef DNA brotið eykst um meira en 120 bp eftir aðlögun tengisins getur það stafað af óeðlilegri brotamagnun á of mikilli PCR mögnun. Fækkun PCR hringrása getur komið í veg fyrir ástandið.

c) Óeðlileg stærð DNA -búða bókasafns eftir millistykki millistykki Lengd millistykkisins í þessum búnaði er 60 bp. Þegar tveir endar brotsins eru tengdir millistykkjum mun lengdin aðeins aukast um 120 bp. Þegar þú notar annan millistykki en sá sem er settur í þennan búnað skaltu hafa samband við birginn til að veita viðeigandi upplýsingar, svo sem lengd millistykkisins. Gakktu úr skugga um að verkflæði tilrauna og aðgerð gangi eftir skrefunum sem lýst er í handbókinni.

d) Óeðlileg DNA brotstærð fyrir millistykki tengingar Ástæðan fyrir þessu vandamáli getur stafað af röngum viðbrögðum við DNA sundrungu. Nota ætti mismunandi viðbragðstíma fyrir mismunandi DNA inntak. Ef DNA inntak er meira en 10 ng mælum við með því að velja viðbragðstíma 12 mín sem upphafstíma fyrir hagræðingu og brotstærðin sem framleidd er á þessum tíma er aðallega á bilinu 300-500 bp. Notendur geta aukið eða minnkað lengd DNA brotanna í 2-4 mínútur í samræmi við eigin kröfur til að hámarka DNA brotin með nauðsynlegri stærð.

A-2

a) Brotunartíminn er ekki fínstilltur Ef sundurliðaða DNA er of lítið eða of stórt, vinsamlegast skoðaðu leiðbeiningar fyrir val á sundrungartíma sem gefnar eru í leiðbeiningunum til að ákvarða viðbragðstímann og notaðu þennan tímapunkt sem stýringu, settu að auki upp hvarfkerfi til að lengja eða stytta 3 mínútur til að gera nákvæmari aðlögun á sundrunartíma.

A-3

Óeðlileg stærðardreifing DNA eftir sundrungarmeðferð

a) Röng þíðaaðferð við sundrunarhvarfefni, eða hvarfefnið er ekki alveg blandað eftir þíðu. Þíðið 5 × brotthvarf ensímblanda hvarfefnið á ís. Þegar þíða hefur verið blandað hvarfefninu jafnt með því að fletta varlega í botn slöngunnar. Ekki hvirfa hvarfefnið!

b) DNA inntaksýnið inniheldur EDTA eða önnur mengunarefni Eyðing á saltjónum og kæliefnum í DNA hreinsunarskrefinu er sérstaklega mikilvæg fyrir árangur tilraunarinnar. Ef DNA er leyst upp í 1 × TE skaltu nota aðferðina sem er í leiðbeiningunum til að framkvæma sundrungu. Ef EDTA styrkur í lausninni er óviss er mælt með því að hreinsa DNA og leysa það upp í afjónuðu vatni til síðari viðbragða.

c) Ónákvæm upphafleg DNA -mæling Stærð sundurleitrar DNA er nátengd magni DNA inntaks. Áður en sundrungarmeðferð er nauðsynleg mæling á DNA með Qubit, Picogreen og öðrum aðferðum er nauðsynlegt til að ákvarða nákvæmlega magn af DNA í hvarfkerfinu.

 d) Undirbúningur hvarfkerfisins fylgir ekki leiðbeiningunum Undirbúningur sundrunarhvarfakerfis verður að fara fram á ís stranglega samkvæmt leiðbeiningunum. Til að tryggja bestu áhrifin ætti að setja alla hvarfhluta á ís og undirbúa viðbragðskerfið að lokinni kælingu. Þegar undirbúningnum er lokið skaltu fletta eða pípa til að blanda vandlega. Ekki hringja!

1. Óviðeigandi blöndunaraðferð (hringiða, ofsafengin sveifla o.s.frv.) Mun valda óeðlilegri dreifingu safnsbrota (eins og sýnt er á eftirfarandi mynd) og hafa þannig áhrif á gæði bókasafnsins. Þess vegna, þegar þú býrð til viðbragðshluta við sundurliðun blanda, vinsamlegast pípaðu varlega upp og niður til að blanda, eða notaðu fingurgóminn til að fletta og blanda jafnt. Gætið þess að blanda ekki við hringiðu.

2. Hreint DNA þarf að nota við byggingu bókasafna

■ Góð heilindi DNA: Rafskautabandið er meira en 30 kb, án hala

■ OD260/230:> 1,5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. Magn innsláttar DNA verður að vera rétt Það er lagt til að nota Qubit og PicoGreen aðferðir til að mæla DNA, frekar en Nanodrop.

4. Innihald EDTA í DNA lausn verður að ákvarða EDTA hefur mikil áhrif á sundrungarviðbrögðin. Ef innihald EDTA er hátt þarf að gera DNA hreinsun fyrir síðari prófun.

5. Brotthvarfshvarflausnin verður að vera unnin á ís Brotunarferlið er viðkvæmt fyrir viðbragðshita og tíma (sérstaklega eftir að bætt hefur verið við aukaefni). Til að tryggja nákvæmni viðbragðstíma, vinsamlegast undirbúið hvarfkerfi á ís.

6. Viðbragðstíminn fyrir sundurliðun verður að vera nákvæmur Viðbragðstími sundrunarþrepsins mun hafa bein áhrif á stærð brotafurðanna og hafa þannig áhrif á stærðardreifingu DNA brota á bókasafninu.

1. Hvers konar sýni á við um þennan búnað?

Viðeigandi sýnisgerð þessa búnaðar getur verið heildar RNA eða hreinsað mRNA með góða RNA heilindum. Ef heildar RNA er notað til að smíða bókasafnið er mælt með því að nota rRNA eyðingarbúnaðinn (Cat#4992363/4992364/4992391) til að fjarlægja rRNA fyrst.

2. Er hægt að nota FFPE sýni til að smíða bókasafn með þessum búnaði?

MRNA í FFPE sýnum verður niðurbrot að vissu marki, með tiltölulega lélegri heilindum. Þegar þessi búnaður er notaður til byggingar bókasafnsins er mælt með því að hámarka brotatímann (stytta sundrungartímann eða framkvæma ekki sundrungu).

3. Hvað gæti valdið því að innsettur hluti sýni lítilsháttar frávik með því að nota stærðarvalskrefið í vöruhandbókinni?

Stærðarval skal fara fram í ströngu samræmi við stærðvalskrefið í þessari vöruhandbók. Ef það er frávik getur ástæðan verið sú að segulkúlurnar eru ekki í jafnvægi við stofuhita eða eru ekki að fullu blandaðar, pípettan er ekki nákvæm eða vökvinn er eftir í oddinum. Mælt er með því að nota ábendingarnar með lítilli aðsog fyrir tilraunina.

4. Val á millistykki í byggingu bókasafna

Bókasafnið er ekki með millistykki hvarfefni og mælt er með því að nota þetta sett ásamt TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC bókasafnsins

Magngreining bókasafns: Qubit og qPCR eru notuð til að ákvarða massastyrk og mólstyrk bókasafnsins í sömu röð. Aðgerðin er stranglega í samræmi við vöruhandbókina. Styrkur bókasafnsins mun almennt uppfylla kröfur NGS raðgreiningar. Greining dreifingarsviðs bókasafns: Notkun Agilent 2100 Bioanalyzer til að greina dreifingarsvið bókasafnsins.

6. Val á magnunarhringrásarnúmeri

Samkvæmt leiðbeiningunum er fjöldi PCR hringrásar 6-12 og fjöldi PCR hringrása sem þarf er að velja í samræmi við inntak sýnisins. Í bókasöfnum með miklum afköstum kemur yfirmögnun venjulega fram í mismiklum mæli, sem birtist með örlítið stærri hámarki eftir hámark markmiðssviðs við greiningu Agilent 2100 Bioanalyzer, eða greindur styrkur Qubit er lægri en qPCR. Mild ofmögnun er eðlilegt fyrirbæri, sem hefur ekki áhrif á röðun bókasafna og síðari gagnagreiningu.

7. Spikes birtast í greiningarsnið Agilent 2100 Bioanalyzer

Útlit toppa í Agilent 2100 Bioanalyzer greiningu er vegna ójafnrar sundrungar sýna, þar sem fleiri brot verða í ákveðinni stærð, og þetta mun verða augljósara eftir auðgun PCR. Í þessu tilfelli er lagt til að ekki vali stærð, þ.e. að setja sundrungarskilyrðið á 94 ° C í 15 mínútur í ræktun, þar sem brotdreifingin er lítil og einbeitt og hægt er að bæta einsleitni.