Fljótur vefstýrður stökkbreytingarsett

A-1 sniðmát

■ Sniðmátið inniheldur prótein óhreinindi eða Taq hemla osfrv .—— Hreinsaðu DNA sniðmát, fjarlægðu prótein óhreinindi eða dragðu út sniðmát DNA með hreinsunarsettum.

■ Afmyndun sniðmátsins er ekki lokið —— Viðeigandi hækkun hitaskynjunarhitastigs og lengja skynjunartíma.

■ Niðurbrot sniðmáts —— Búðu til sniðmátið aftur.

A-2 grunnur

■ Léleg gæði grunna —— Endurgera grunninn.

■ Niðurbrot grunnur ——Færðu háan styrk grunninn í lítið magn til varðveislu. Forðist að frjósa og þíða oft eða við 4 ° C hitaeiningu til lengri tíma.

■ Óviðeigandi hönnun grunna (td grunnlengd er ekki nægjanleg, dimer myndaður á milli grunna o.s.frv.) -Endurhannaðu grunna (forðist myndun grunndimers og auka uppbyggingar)

A-3 mg²⁺einbeitingu

■ Mg²⁺ styrkur er of lítill —— Rétt aukning á Mg²⁺ einbeiting: Fínstilltu Mg²⁺ styrkur með röð hvarf frá 1 mM til 3 mM með 0,5 mM bili til að ákvarða ákjósanlegan Mg²⁺ styrkur fyrir hvert sniðmát og grunn.

A-4 Glæðishiti

■ Hátt glæðingarhitastig hefur áhrif á bindingu grunns og sniðmáts. ——Lækkaðu hitaglæðann og fínstilltu ástandið með 2 ° C halla.

A-5 framlengingartími

■ Stuttur framlengingartími —— lengja lengingu.

Fyrirbæri: Neikvæð sýni sýna einnig markbandsröðina.

A-1 mengun PCR

■ Krossmengun á markröð eða magnunarvörum —— Varlega skal ekki setja sýnið sem inniheldur markröðina í pípu í neikvæða sýnið eða hella því út úr skilvinduglasinu. Hvarfefnin eða búnaðurinn ætti að vera sjálfstýrður til að útrýma fyrirliggjandi kjarnsýrum og ákvarða tilvist mengunar með neikvæðum eftirlitstilraunum.

■ Mengun hvarfefnis —— Hreinsið hvarfefnin og geymið við lágt hitastig.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ styrkur er of lítill —— Rétt aukning á Mg²⁺ einbeiting: Fínstilltu Mg²⁺ styrkur með röð hvarf frá 1 mM til 3 mM með 0,5 mM bili til að ákvarða ákjósanlegan Mg²⁺ styrkur fyrir hvert sniðmát og grunn.

■ Óviðeigandi grunnhönnun og miðaröðin hefur samsvörun við röð sem ekki er miðuð. —— Endurhönnun grunnur.

Fyrirbæri: PCR mögnunarböndin eru í ósamræmi við væntanlega stærð, annaðhvort stór eða lítil, eða stundum eiga sér stað bæði sértæk mögnunarbönd og ósértæk mögnunarbönd.

A-1 grunnur

■ Léleg grunnleiki

—— Endurhönnun grunnur.

■ Grunnþéttleiki grunnsins er of hár ——Hækka eðlilega hitastigið rétt og lengja skynjunartímann.

A-2 mg²⁺ einbeitingu

■ Mg²⁺ styrkur er of hár ——Lækkaðu Mg2+ styrkinn rétt: Fínstilltu Mg²⁺ styrkur með röð hvarf frá 1 mM til 3 mM með 0,5 mM bili til að ákvarða ákjósanlegan Mg²⁺ styrkur fyrir hvert sniðmát og grunn.

A-3 hitastöðug fjölliðu

■ Of mikið magn ensíma —— Draga úr ensímmagni með viðeigandi millibili um 0,5 U.

A-4 Glæðishiti

■ Glæðingarhitastigið er of lágt —— Viðeigandi hækkun á glæðingarhitastigi eða notaðu tveggja þrepa glæðingaraðferðina

A-5 PCR hringrásir

■ Of mörg PCR hringrás —— Fækkaðu PCR hringrásum.

A-1 grunnur——Léleg sértækni ——Hönnaðu grunninn að nýju, breyttu stöðu og lengd grunnunnar til að auka sérstöðu hans; eða framkvæma hreiður PCR.

A-2 sniðmát DNA

—— Sniðmátið er ekki hreint —— Hreinsið sniðmátið eða dragið út DNA með hreinsibúnaði.

A-3 mg²⁺ einbeitingu

——Mg²⁺ styrkur er of hár ——Lækkaðu Mg rétt²⁺ einbeiting: Fínstilltu Mg²⁺ styrkur með röð hvarf frá 1 mM til 3 mM með 0,5 mM bili til að ákvarða ákjósanlegan Mg²⁺ styrkur fyrir hvert sniðmát og grunn.

A-4 dNTP

—— Styrkur dNTP er of hár —— Dragðu úr styrk dNTP á viðeigandi hátt

A-5 Glæðishiti

—— Of lágt glæðingarhitastig —— Viðeigandi hækkun á glæðingarhitastigi

A-6 hringrásir

——Af mörgum hringrásum —— Háttu hringrásarnúmerið

Fyrsta skrefið er að velja viðeigandi fjölliðu. Venjulegur Taq pólýmerasi getur ekki prófarkalestur vegna skorts á 3'-5 'exonuclease virkni og misræmi mun stórlega draga úr skilvirkni brotanna. Þess vegna getur venjulegur Taq fjöllasi ekki magnað markbrot stærri en 5 kb á áhrifaríkan hátt. Taq pólýmerasa með sérstakri breytingu eða annarri hágæða fjölliðu ætti að velja til að bæta framlengingu skilvirkni og mæta þörfum langrar brotamagnunar. Að auki krefst mögnun langra brota samsvarandi aðlögun grunnhönnunar, afmyndunartíma, framlengingartíma, sýrustig buffer osfrv. Venjulega geta grunnir með 18-24 bp leitt til betri uppskeru. Til að koma í veg fyrir skemmdir á sniðmátum, ætti að minnka tímasetninguna við 94 ° C í 30 sekúndur eða minna í hverri lotu og tíminn til að hækka hitastigið í 94 ° C fyrir mögnun ætti að vera styttri en 1 mín. Þar að auki getur stilling hitastigs á um það bil 68 ° C og hönnun framlengingartíma í samræmi við hraða 1 kb/mín tryggt skilvirka mögnun langra brota.

Hægt er að minnka villuhlutfall PCR mögnunar með því að nota ýmsa DNA fjölliður með mikilli tryggð. Meðal allra Taq DNA fjölliða sem fundist hafa hingað til hefur Pfu ensím lægsta villuhlutfallið og hæsta tryggðina (sjá meðfylgjandi töflu). Til viðbótar við ensímval geta vísindamenn enn frekar dregið úr PCR stökkbreytingarhraða með því að fínstilla viðbragðsaðstæður, þar með talið að hámarka biðmassasamsetningu, styrk hitastöðugrar fjölliðu og fínstilla PCR hringrásarnúmer.