FastKing RT Kit (Með gDNase)

A-1 RNA er niðurbrotið

——Hreinsaðu hágæða RNA án mengunar. Efnið sem RNA er dregið úr ætti að vera eins ferskt og mögulegt er til að koma í veg fyrir niðurbrot RNA. Greindu heilindi RNA á mótvægis hlaupi fyrir RT hvarf. Eftir útdrátt RNA ætti að geyma það í 100% formamíði. Ef RNase hemill er notaður ætti hitunarhitastigið að vera <45 ° C og pH ætti að vera lægra en 8,0, annars losar hemillinn allan bundinn RNasa. Ennfremur ætti að bæta RNasa hemli í lausnir sem innihalda ≥ 0,8 mM DTT.

A-2 RNA inniheldur hemla andstæða umritunarviðbragða

—— Hinsegin umritunarhemlar innihalda SDS, EDTA, glýseról, natríumpýrófosfat, spermidín, formamíð, guanidinsalt osfrv. Blandið saman viðmiðunar -RNA með sýninu og berið ávöxtunina saman við viðmiðunar -RNA viðbrögðin til að athuga hvort það sé hemill. Þvoið RNA úrkomu með 70% (rúmmáli) etanóli til að fjarlægja hemla.

A-3 Ófullnægjandi glæðing grunna sem notaðir eru til að mynda fyrsta streng cDNA

—— Ákveðið að hitunarhitinn henti grunnunum sem notaðir voru í tilrauninni. Fyrir handahófi hexamer er mælt með því að halda hitastigi við 25 ° C í 10 mínútur áður en hvarfhitastigið er náð. Fyrir genasérhæfða grunna (GSP) skaltu prófa aðra GSP eða skipta yfir í oligo (dT) eða random hexamer.

A-4 Lítið magn af upphafs RNA

—— Auka magn RNA. Fyrir RNA sýni minna en 50 ng er hægt að nota 0,1 míkrógrömm til 0,5 míkróg asetýl BSA við fyrstu streng cDNA myndun

A-5 Markröðin er ekki gefin upp í greindum vefjum.

—— Prófaðu aðra vefi.

A-6 PCR viðbrögð mistakast

—— Fyrir tveggja þrepa RT-PCR getur cDNA sniðmátið í PCR þrepinu ekki farið yfir 1/5 af viðbragðsmagninu.

A-1 Ósértæk glæðing grunna og sniðmáta

—— 3'-endi grunnunnar ætti ekki að innihalda 2-3 dG eða dC. Notaðu genasérhæfða grunna í myndun fyrsta strengsins í stað handahófs grunna eða oligo (dT). Notaðu hærra glæðishita í fyrstu lotunum og síðan lægra glæðishita. Notaðu Taq DNA pólýmerasa fyrir upphaflega PCR til að bæta sérstöðu hvarfsins.

A-2 Léleg hönnun genasértækra grunna

——Fylgdu sömu grundvallarreglum varðandi hönnun grunnmögnunar.

A-3 RNA mengað erfðamengi DNA

——Höndlaðu RNA með PCR-gráðu DNasa I. Settu upp viðbragðshvarf án öfugrar umritunar til að greina DNA-mengun.

A-4 Myndun grunndimers

—— Hönnun grunnur án viðbótar raða í 3 'enda.

A-5 Of hátt Mg²⁺ einbeitingu

—— Háttu Mg²⁺ styrkur fyrir hvert sniðmát og grunnblöndu

A-6 mengað af erlendu DNA

—— Notaðu úðabrúsaþolnar ábendingar og UDG ensím.

A-1 Innihald fyrstu vörunnar er of hátt

—— Minnka magn fyrstu strengjarafurðarinnar í hefðbundnu PCR hvarfþrepi.

A-2 Of mikið grunnefni í PCR viðbrögðum

—— Minnka grunninngang.

A-3 Of margar lotur

—— Háttu PCR viðbragðsaðstæður og fækkaðu PCR hringrásartölu.

A-4 Of lágt glæðishiti

——Hækkaðu glæðingarhitastig til að koma í veg fyrir ósérhæfða upphaf og framlengingu.

A-5 Ósértæk mögnun oligonucleotide búta sem myndast við DNase niðurbrot DNA —— Dragðu hágæða RNA út til að koma í veg fyrir DNA-mengun.

RT-PCR er að bakfæra umritun RNA í cDNA og nota síðan öfugt umritað cDNA sem sniðmát fyrir PCR viðbrögð til að magna markbrotið. Veldu annaðhvort handahófi grunna, Oligo dT og genasérhæfða grunna í samræmi við sérstakar aðstæður tilraunarinnar. Öll ofangreind frumefni er hægt að nota fyrir stutt heilkjörnungafrumu -mRNA án hárnálaruppbyggingar.

Random primer: Hentar fyrir langt RNA með hárnálaruppbyggingu, svo og alls kyns RNA eins og rRNA, mRNA, tRNA osfrv. Þau eru aðallega notuð við RT-PCR viðbrögð eins sniðmáts.

Oligo dT: Hentar fyrir RNA með PolyA hali (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA og tRNA eru ekki með PolyA hala). Vegna þess að Oligo dT er bundið við PolyA hala þarf gæði RNA sýna að vera mikil og jafnvel lítið niðurbrot mun draga verulega úr cDNA myndun í fullri lengd.

Gensértækur grunnur: viðbót við sniðmátsröðina, hentugur fyrir aðstæður þar sem markröðin er þekkt.

Það eru tvær leiðir:

1. Innri tilvísunaraðferð: Fræðilega séð er cDNA DNA brot af mismunandi lengd, þannig að afleiðing rafskauts er smear. Ef RNA gnægð er lítil mun engin vara birtast við rafskaut, en það þýðir ekki að engin vara mun magnast upp með PCR. Almennt er hægt að nota innri tilvísun til að greina cDNA. Ef innri tilvísunin hefur niðurstöður er í grundvallaratriðum hægt að tryggja gæði cDNA (í nokkrum tilvikum, ef markgena brotið er of langt, geta verið undantekningar).

2. Ef það er þekkt gen magnað með þessu sniðmáti er hægt að sannreyna það með frumum þessa gena. Mögnun innri tilvísunar þýðir ekki endilega að það sé ekkert vandamál með cDNA. Vegna þess að innri tilvísun hefur mikið magn af cDNA er auðvelt að magna upp. Ef cDNA er niðurbrot að hluta til af ýmsum ástæðum, frá sjónarhóli líkinda, mun PCR niðurstöður lítils háttar markgena hafa mikil áhrif. Þó að innri tilvísun sé enn mikil í miklu magni mun líklega ekki hafa áhrif á mögnunina.

Niðurbrot að hluta til á RNA. Greindu heilindi og hreinsaðu RNA

RNA innihald mismunandi tegunda getur verið mismunandi, en almennt ætti útdráttur heildar RNA að innihalda tvö tær 28S og 18S hljómsveitir í hlaupskautun, og birtustig fyrri bandsins ætti að vera tvöfalt hærra en þess síðarnefnda. 5S hljómsveitin gefur til kynna að RNA hafi brotnað niður og birtustig hennar sé í réttu hlutfalli við niðurbrot. Árangursrík mögnun innri tilvísunar þýðir ekki að það sé ekkert vandamál með RNA, vegna þess að innri tilvísunin er í miklu magni, hægt er að magna RNA svo framarlega að niðurbrotið sé ekki alvarlegt. OD₂₆₀/OD₂₈₀hlutfall hreint RNA sem mælt er með litrófsmæli ætti að vera á bilinu 1,9 til 2,1. Lítið magn af prótein óhreinindum í RNA mun minnka hlutfallið. Svo lengi sem verðmæti er ekki of lágt, mun RT ekki hafa áhrif. Það sem skiptir mestu máli fyrir RT er heilindi RNA.

Lenging innra tilvísunargensins getur aðeins bent til þess að RT hafi tekist, en það er ekki endilega tengt gæðum cDNA strengsins. Vegna þess að innri tilvísunarbrotin eru almennt lítil að stærð og mikil tjáning, þeim er auðveldara að ná árangri í öfugri umritun. Stærð og tjáning markgena er þó mismunandi eftir genum. Ekki er hægt að dæma cDNA gæði aðeins með innri tilvísun sérstaklega fyrir markbrotin lengri en 2 kb.

Sum sýni hafa flókin efri mannvirki, eða hafa ríkt GC innihald, eða eru dýrmæt með lítið magn. Í þessum tilvikum ætti að velja viðeigandi öfugan umritun í samræmi við stærð markbrotsins og sýnisins. Fyrir RNA sniðmát með hátt GC innihald og flókið efri uppbyggingu er erfitt að opna efri uppbyggingu við lágt hitastig, eða með algengum öfugri umritun. Fyrir þessi sniðmát er hægt að velja Quant Reverse Transcriptase, þar sem andstæða afritunarárangur þess er augljóslega betri en M-MLV röð andstæða transcriptase, sem getur bakað umritað ýmis RNA sniðmát á skilvirkan hátt og umritað RNA í cDNA fyrsta streng að hámarki. Þegar almennt öfugt umritunarbúnað er notað getur 20 μl kerfi aðeins í raun snúið við umritun 1 μg af heildar RNA. Vinsamlegast athugið hámarks RT getu búnaðarins. Ef sniðmátinu er bætt við umfram, mun öfug umritun gagnast RNA með mikilli gnægð. Þess vegna er betra að fara ekki yfir hámarksgetu kerfisins.

A-1 Ákveðið hvort RNA sé niðurbrotið alvarlega og hvort RT hafi árangur

Almennt er ástæðan fyrir bilun í innri tilvísunarmögnun oft af völdum alvarlegrar RNA niðurbrots. Önnur möguleg ástæða er bilun í umritun. Ekki er hægt að nota innri tilvísun sem staðal til að dæma um gæði cDNA einstrengis, en það er hægt að nota það sem staðal til að dæma um hvort öfug umritun heppnist ef ekkert vandamál er með RNA gæði. Það mikilvægasta í öfugu umritunarferlinu er að viðhalda stöðugu hitastigi og stöðugu hvarfkerfi til að bæta skilvirkni hvarfsins.

A-2 Ákveðið hvort grunnar til að magna innri tilvísunargen séu áreiðanlegir og hvort einhver vandamál séu með hvarfefni sem notuð eru í PCR.

Til hlutfallslegrar mælingar verður að mæla RNA fyrir öfugan umritun, sem einnig er krafist í mörgum öfugum umritunarsettum, til dæmis að mæla RNA inntakið sem 1 μg. Þar sem öfugt umritað cDNA er blönduð lausn, þar með talið RNA, oligo dT, ensím, dNTP, og jafnvel smá DNA leifar, mun frávik valda, svo það er ómögulegt að mæla cDNA með nákvæmum hætti. Þess vegna er magn RNA nauðsynlegt. Miðað við að öfug umritunarvirkni er sú sama hjá mismunandi sýnum, magn cDNA sem fæst ætti að vera það sama og megindleg greining getur sýnt samanburð á tjáningarstigi mismunandi gena í sama magni af heildar RNA. Þegar framkvæmt er hlutfallslegt flúrljómun magnbundið PCR, er ekki víst að magngilt cDNA sé krafist eftir öfugri umritun vegna þess að hægt er að láta innra tilvísunargenið sem tilvísun.

Það er aðallega tengt genunum og öfug umritun á löngu broti er ekki gerleg fyrir flest gen. Í fyrsta lagi er skilvirkni öfugrar umritunar mun lægri en PCR. Í öðru lagi takmarkar GC rík svæði og efri uppbygging margra gena bæði öfug umritun og PCR. Að lokum er erfitt að tryggja tryggð og mögnun skilvirkni PCR á sama tíma. Við öfug umritun getur enginn ábyrgst að fá langt brot fyrir lítil afritunargen, sérstaklega með því að nota oligo dT. Hvað varðar 5 'UTR með meira GC, þá er það enn erfiðara. Þess vegna er það enn skynsamleg aðferð til að snúa við afritun með handahófi grunnum, finna náttúrulega klofningarsvæðin í markbrotinu, magna upp með hlutum og framkvæma síðan takmarkanir á meltingu og tengingu. Almennt er erfitt að magna beint upp brot sem eru stærri en 2 kb, en það er ekki alltaf ómögulegt að fá: 1. Í fyrsta lagi að tryggja heilindi RNA/mRNA og TRIZOL útdráttur er ákjósanlegur. 2. M-MLV RT-PCR búnað er hægt að nota beint. Lengja glæðutíma og auka hringrásartölu í mögnunarferlinu á réttan hátt. Að öðrum kosti er hægt að nota verndaða PCR eða framkvæma eitt eða tvö viðbrögð fyrst með viðeigandi lengingu á náttúrun og framlengingu áður en venjuleg PCR mögnun, sem getur hjálpað til við að lengja brot. Gefðu gaum að tryggð fjölliðunnar. 3. Long Taq er hægt að nota í PCR til að fá kjörinn árangur. 4. Fyrir prótein tjáningu umsókn, hár trúnaður pólýmerasa ætti að beita.

TIANGEN býður upp á tvenns konar andstæða umritun: Quant/King RTase og TIANScript M-MLV. Aðalmunurinn á milli þeirra er inntaksmagn sniðmáta. Quant er einstakur andstæða umritun, sem er frábrugðin venjulegu M-MLV sem er fengið úr Moloney murine hvítblæði veiru. Quant er nýr afkastamikill andstæða umritun sem er raðað upp með Escherichia coli verkfræði. Quant hentar til að magna upp 50 ng-2 μg af RNA með mikilli öfugri umritunarvirkni og mikilli ávöxtun. Í samanburði við venjulegt MMLV eða AMV, stærsta einkenni Quant er að það hefur mjög sterka sækni við RNA sniðmát og getur snúið við afritun flókinna sniðmáta án hátt hitastigs afmyndunar. Fyrir sniðmát með hærra GC efni er öfug skilvirkni meiri. Hins vegar hefur þessi öfuga afritun RNasa H virkni, sem getur haft áhrif á lengd cDNA vörunnar (hentar fyrir <4,5 kb sniðmát). Fyrir hefðbundna öfuga umritun er mælt með TIANScript MMLV bakriti. Þessi RTasi er breytt ensím með mjög veika RNasa H virkni, sem hentar fyrir langa (> 5 kb) cDNA myndun.

Einu þrepi öfugri umritun og PCR mögnun er lokið í sama túpu án þess að opna slöngulokið milli cDNA myndunar og mögnunar, sem er gagnlegt til að draga úr mengun. Þar sem öll fengin cDNA sýni eru notuð til mögnunar er næmnin meiri, að lágmarki 0,01 pg af heildar RNA. Til að ná árangri í einu skrefi RTPCR eru genasértækir grunnir almennt notaðir til að hefja myndun cDNA. Tvíþrepa aðferðin, nefnilega öfug umritun og PCR mögnun fer fram í tveimur skrefum. Í fyrsta lagi fer öfug umritun fram frá RNA sniðmáti til að fá cDNA og fengin cDNA verður fyrir einu eða fleiri mismunandi PCR viðbrögðum. Tveggja þrepa aðferðin getur notað oligo (dT) eða handahófi grunna til að leiðbeina myndun fyrsta strengsins af cDNA og getur umritað allar mRNA upplýsingar frá tilteknu sýni.